Sara Tamminga

Antibiotica hebben talloze levens gered door infecties te behandelen en moderne medische procedures mogelijk te maken. Echter, veroorzaakt de opkomst van antibioticaresistentie mogelijk een terugkeer naar het pre-antibioticatijdperk en wordt er verwacht dat de sterfte door antimicrobiële resistentie de komende 25 jaar wereldwijd met 70% zal toenemen.

Vaccinatie is een veelbelovende strategie om ernstige bacteriële infecties te voorkomen, maar eectieve vaccins voor de opportunistische ziekteverwekkers Staphylococcus aureus (S. aureus) en Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) ontbreken helaas nog steeds. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) heeft deze bacteriën geclassiceerd als ziekteverwekkers met hoge prioriteit voor vaccinonderzoek. Alternatieve strategieën, zoals monoklonale antilichamen en fagen, worden ook onderzocht.

S. aureus en S. pyogenes koloniseren 10-30% van de bevolking zonder dat mensen daar symptomen van hebben (= asymptomatisch). Ze kunnen echter ook huid- en zacht weefselinfecties veroorzaken, variërend van milde (bijvoorbeeld: impetigo en folliculitis) tot ernstige infecties (zoals necrotiserende fasciitis en chirurgische wondinfecties). Het bestuderen van lokale afweersystemen in de huid kan helpen identiceren waarom sommige mensen infecties ontwikkelen terwijl anderen asymptomatisch blijven. Deze kennis kan nuttig zijn bij de ontwikkeling van eectieve therapieën die deze opportunistische ziekteverwekkers bestrijden.

In dit proefschrift hebben we ons speciek gericht op de interactie tussen het menselijke immuunsysteem en de oppervlakte suikers (glycanen) van S. aureus en S. pyogenes. Hoofdstuk 2 en hoofdstuk 3 van dit proefschrift richten zich speciek op S. aureus. In hoofdstuk 2 hebben we ons gefocust op de wall teichoic acids (WTA’s), dit zijn lange rechte ketens van moleculen die verankerd zijn in de celwand van S. aureus. Ze spelen een rol bij de kolonisatie van S. aureus in de menselijke neus, faag-gemedieerde horizontale genoverdracht en antibioticaresistentie. WTA bestaat uit een gepolymeriseerde ribitolfosfaat keten die gedecoreerd (geglycosyleerd) kan worden met een speciek suiker molecuul: N-acetylglucosamine (GlcNAc). Dit gebeurt door drie enzymen (glycosyltransferases): TarS, TarM en TarP. TarS en TarP koppelen GlcNAc aan de respectievelijk C-4 en C-3 posities van een ribitolfosfaat molecuul met een β-conguratie. TarM voegt, net als TarS, GlcNAc toe op de C-4 positie van een ribitolfosfaat molecuul, maar dan met een α-conguratie. Deze glycosyleringspatronen of “suiker-jasjes” beïnvloeden de herkenning van S. aureus door het menselijk immuun systeem. In dit hoofdstuk we ons gericht op de distributie en genetische diversiteit van de drie glycosyltransferases (TarS, TarP en TarM). We analyseerden de genoom sequenties van 25.652 S. aureus bacteriën en ontdekten dat meer dan 99% tarS bevatte, en daarnaast bevatte 37% naast tarS ook nog tarM en 7% bevatte naast tarS ook tarP. Verder observeerden we allelen (variaties) van deze genen die, in belangrijke onderdelen van het enzym, een mutatie of premature stop codon bevatten. Dit betekent dat het enzym, ofwel op belangrijke plekken een ander aminozuur bevatte, of dat het enzym een stuk korter was dan normaal. De expressie van deze afwijkende enzymen in een bacterie stam waar de originele enzymen uit zijn verwijderd, vertoonde sterk verminderde of afwezige suiker decoraties op het WTA van de bacterie. Dit betekent dat de gevonden afwijkende varianten van TarS, TarP of TarM niet functioneel zijn. Dit zorgde ervoor dat de bacterie niet meer herkent werd door specieke monoklonale antilichamen en de humane immuun receptor langerin. Hoofdstuk 2 geeft hiermee een breed overzicht van de genetische diversiteit van de drie WTA enzymen (glycosyltransferases) in de populatie van S. aureus en de functionele gevolgen hiervan voor herkenning van de bacterie door het menselijk immuun systeem.

In hoofdstuk 3 richtten we ons op de rol van Langerhans cellen (LC) in eczeem, ook bekend als atopische dermatitis (AD). Eczeem is een chronische ontstekingsaandoening aan de huid die wereldwijd 230 miljoen mensen treft. Het is een multifactoriële ziekte die wordt gekenmerkt door een ontregeld afweersysteem en een afwijkende huidmicrobiota samenstelling, waarbij S. aureus overheersend vaak en veel aanwezig is op de eczeem laesies. Langerhans cellen zijn een soort schildwacht immuun cellen die zich in de bovenste huidlaag (opperhuid, epidermis) bevinden. Sommige specieke glycosyleringspatronen of “suiker-jasjes” van S. aureus WTA versterken ontstekingsreacties door interactie met Langerhans cellen. In hoofdstuk 3 hebben we ‘single-cell RNA sequencing’ van Langerhans cellen en T cellen van gezonde mensen en eczeem patiënten uitgevoerd. Single cell RNA sequencing betekent dat we van individuele cellen alle RNA moleculen hebben gesequenced, zodat we per cel kunnen vastleggen welke RNA moleculen het produceert. Daarnaast hebben we de “suiker-jas” van S. aureus, die afkomstig was van de eczeemplekken van patiënten, geanalyseerd. We vonden vier verschillende subpopulaties van Langerhans cellen. Twee ‘steady-state’ clusters (LC1 en LC1H) en twee pro-inammatoire/mature clusters (LC2 en migrerende LCs). Deze laatste twee clusters waren signicant meer aanwezig in eczeem huid vergeleken met gezonde huid. Verder vonden we een verhoogde expressie van C-type lectinereceptoren, de hoge aniteit IgE receptor en de synthese van prostglandines en leukotrienes in Langerhans cellen van eczeem patiënten. Daarnaast identiceerden we opgereguleerde transcriptionele routes (series van aan elkaar gelinkte genen), die gerelateerd zijn aan T cel activering, in eczeem Langerhans cellen. Dit werd bevestigd doordat we een verhoogde hoeveelheid T helper 2 cellen en regulerende T cellen in eczeemhuid vonden vergeleken met de gezonde huid. Tot slot stimuleerden we gezonde menselijke Langerhans cellen met de S. aureus bacteriën die we uit de eczeem laesies isoleerden. Hierop voerden we bulk RNA sequencing uit. Dit betekent dat we alle RNA moleculen van alle Langerhans cellen van één donor hebben gesequenced met of zonder stimulatie van S. aureus, zodat we konden vastleggen welke RNA moleculen de Langerhans cellen dan produceren. Dit liet verhoogde expressie van T helper 2 cel-gerelateerde routes in de Langerhans cellen die werden gestimuleerd met S. aureus vergeleken met de ongestimuleerde Langerhans cellen. Alles bij elkaar genomen laten deze bevindingen zien dat er mogelijk een rol bestaat voor Langerhans cellen in eczeem. Hierbij verbinden de Langerhans cellen mogelijk de dominante aanwezigheid en kolonisatie van S. aureus in de opperhuid (epidermis) met de ontregelde T helper 2 cel reacties in de dermis van eczeem laesies.

In hoofstuk 4 en 5 richtten we ons op S. pyogenes, een bacterie die wereldwijd een belangrijke bijdrage levert aan infectie-gerelateerde sterfgevallen. Hoofdstuk 4 gaat over de Group A Carbohydrate (GAC), dat kenmerkend is voor S. pyogenes en in alle stammen voorkomt. GAC bestaat uit een lange keten van rhamnose moleculen die verankerd zijn in de cel wand van S. pyogenes, en gedecoreerd zijn met GlcNAc suiker zijketens. Een deel van die GlcNAc zijketens (ongeveer 25%) is nog verder gemodiceerd met glycerolfosfaat. De genen in het gacA-L gen-cluster van S. pyogenes zijn essentieel voor het maken van GAC. Hiervan zijn gacI-L verantwoordelijk voor de GlcNAc en glycerolfosfaat decoratie, die zorgt voor agglutinatie in de diagnostische tests voor S. pyogenes, en tegelijkertijd bijdraagt aan virulentie van deze bacterie. Historisch onderzoek uit de jaren ’40 en ’50 van de vorige eeuw beschreef S. pyogenes stammen die hun GlcNAc suiker zijketens verloren na meerdere keren door muizen of konijnen te zijn gepasseerd, en noemde deze stammen “A varianten”. In hoofdstuk 4 hebben we de genoom sequentie van één historisch paar, de originele stam en de A variant, kunnen analyseren. Hierbij vonden we een inactiverend stop codon in het gen dat codeert voor GacI, wat het verlies van de GlcNAc suiker zijketen verklaart. Vervolgens analyseerden we de genetische diversiteit van de 12 gacA-L genen in een verzameling van 2.044 S. pyogenes genoomsequenties. We identiceerden 31 isolaten (1.5%) met een voortijdig stop codon in één van de gac genen. Bijna 40% van deze isolaten had zo’n voortijdig stop codon in gacH. Expressie van deze varianten in een mutant waaruit de originele gacH was verwijderd, bevestigde het verlies van functie, aangezien er een signicante vermindering van glycerolfosfaat werd vastgesteld met een celwand analyse. Daarnaast hebben we aangetoond dat bacteriën die deze inactieve gacH varianten tot expressie brengen, volledig resistent bleken tegen het humaan bactericide enzym IIA fosfolipase. Hoofdstuk 4 geeft een uitgebreid overzicht van de genetische variatie in het gacA-L gencluster binnen een wereldwijde diverse populatie van S. pyogenes stammen. Daarnaast laten we de functionele implicaties van GacH variatie, in de context van herkenning en uitschakeling door het menselijk immuunsysteem, zien.

In hoofdstuk 5 bestuderen we de interactie tussen S. pyogenes en Langerhans cellen door middel van transcriptionele analyse met focus op langerin als interacterende receptor. Langerin is een C-type lectine receptor die aniteit heeft voor suiker (glycaan) structuren. Hieronder vallen mannose, β-GlcNAc en β-glucaan. We ontdekten dat langerin bindt aan verschillende S. pyogenes stammen met verschillende sterktes. Daarnaast gebruikten we een gemiddeld-sterk bindende stam om menselijke Langerhans cellen te stimuleren. Bij stimulatie met S. pyogenes zagen we dat Langerhans cellen een verhoogde expressie van CCL3, CCL4, MMP12 en IL10 lieten zien. Dit geeft aan dat blootstelling aan S. pyogenes verschillende functies in Langerhans cellen activeert. Vervolgens gebruikten we een ‘Krmit transposon library’-screening om S. pyogenes genen te identiceren die betrokken zijn bij binding door langerin. Een transposon library is simpel gezegd een buisje vol met bacteriën die allemaal een inactivatie hebben van één enkel gen. Iedere bacterie bevat dus alle genen behalve één. Hiermee kun je dan screenen welk genen betrokken zijn bij bepaalde functies, zoals in dit geval de binding aan de langerin receptor. Validatie experimenten bevestigden dat het inactiveren (verwijderen) van de genen emm en mga in verschillende S. pyogenes stammen de binding met langerin signicant verminderde. Daarnaast lieten we zien dat als je emm3 tot expressie brengt in een S. pyogenes stam zonder emm de binding met langerin wordt hersteld. Interessant genoeg gebeurd dit niet als je het M3 eiwit tot expressie brengt in een andere bacteriesoort, namelijk Lactococcus lactis. Deze bevindingen suggereren dat, naast M3 eiwit, aanvullende factoren in S. pyogenes nodig zijn voor de binding van langerin. Deze observaties dragen bij aan ons begrip van de interacties die plaatsvinden tussen deze opportunistische ziekteverwekker en het menselijk immuunsysteem. Dit is belangrijk voor het ontwikkelen van nieuwe strategieën om S. pyogenes infecties te voorkomen en te behandelen.

Samengenomen biedt het onderzoek dat in dit proefschrift wordt beschreven een uitgebreid overzicht van genetische diversiteit in de enzymen die verantwoordelijk zijn voor het synthetiseren van WTA en GAC, respectievelijk in S. aureus en S. pyogenes. Daarnaast beschrijft het de impact van suikerdiversiteit op de interactie met het menselijk immuunsysteem, speciek gefocust op de menselijke Langerhans cel. Aangezien de toename van antimicrobiële resistentie een wereldwijde bedreiging voor de volksgezondheid vormt, is het belangrijk dat onderzoek zich richt op alternatieve strategieën zoals vaccins, fagen en antilichamen. Om dergelijke therapieën succesvol te kunnen ontwikkelen, is uitgebreide kennis van de interacties tussen bacteriën en het menselijk immuunsysteem nodig. Dit proefschrift benadrukt het belang van het bestuderen van genetische diversiteit van oppervlakte suikers en hun rol in herkenning van de bacterie door het menselijk immuunsysteem, wat waardevolle inzichten biedt voor toekomstig onderzoek en mogelijke behandelingen.