Fenghua Zhao

De extracellulaire matrix (ECM) speelt een fundamentele rol in het reguleren van cellulair gedrag, weefselstructuur en ziekteprogressie via haar biochemische en biomechanische eigenschappen. Als een dynamisch en weefselspecifiek scaffold biedt de ECM niet alleen fysieke ondersteuning, maar beïnvloedt deze ook relevante processen zoals celdifferentiatie, migratie en matrixremodellering. Bij fibrotische ziekten en wondgenezing zijn veranderingen in ECM mechanica nauw verbonden met pathologische uitkomsten.

Dit proefschrift richt zich op de ontwikkeling en toepassing van orgaan-specifieke ECM hydrogels als geavanceerde 3D-cultuursystemen die het natuurlijke weefselmilieu nauwkeurig nabootsen. Door de mechanische eigenschappen en samenstelling van ECM hydrogels aan te passen, onderzochten we hun effect op endotheelcellen, fibroblasten en mesenchymale stamcellen in de context van vaatvorming, littekenvorming en fibrose. Via een reeks experimentele modellen biedt dit werk mechanistische inzichten in hoe de stijfheid van ECM cellulaire responsen beïnvloedt, met name ECM remodellering.

Hoofdstuk 2 introduceert de ontwikkeling en toepassing van orgaan-specifieke ECM hydrogels, met nadruk op hun biochemische en biomechanische mogelijkheden voor het reguleren van celgedrag. In tegenstelling tot 2D systemen repliceren deze 3D hydrogels de mechanica van natuurlijk weefsel beter en ondersteunen ze het continue volgen van ECM dynamiek zoals deze wordt uitgevoerd door de ingekapselde cellen. De mechanische eigenschappen van ECM hydrogels kunnen worden afgestemd om zowel gezonde als fibrotische omstandigheden na te bootsen, waardoor het krachtige hulpmiddelen zijn voor het bestuderen van cel–ECM interacties.

In Hoofdstuk 3 onderzochten we de mechanische verschillen van ECM hydrogels afkomstig uit huid, long en een hybride mengsel (1:1 mix), en hun invloed op de vorming van vasculaire netwerken (VNF) en ECM remodellering door endotheelcellen. Fysische karakterisering toonde duidelijke verschillen tussen de hydrogels in stijfheid, viscositeit, vezeldiameter, poriegrootte en vezeldichtheid. Na celkweek bevorderden huid-afgeleide ECM hydrogels de VNF het meest efficiënt vergeleken met long- en hybride hydrogels. Huid ECM hydrogels induceerden hogere secretie van matrixmetalloproteïnase 1 (MMP1), terwijl hybride hydrogels geassocieerd waren met verhoogde MMP9 secretie en meer afzetting van fibronectine en collageen IV. Principale componentenanalyse benadrukte dat mechanische eigenschappen (zoals stijfheid, spanningsrelaxatie) een grotere invloed hadden op VNF dan de biochemische samenstelling. Het onderzoek benadrukte dat de specifieke eigenschappen van ECM van verschillende organen van invloed zijn op hun vermogen om VNF te ondersteunen.

Hoofdstuk 4 onderzochten we hoe fibroblasten de matrix moduleren om angiogenese te ondersteunen in co-culturen van endotheelcellen en fibroblasten binnen huid-ECM hydrogels. Fibroblasten verhoogden de hydrogelstijfheid, vezeldiameter en porositeit terwijl ze de afzetting van fibronectine en fibuline-1 nabij endotheelcellen bevorderden. Deze bevindingen suggereren dat fibroblasten dynamisch kunnen samenwerken met endotheelcellen en het ECM-microklimaat kunnen veranderen om vascularisatie te bevorderen.

In Hoofdstuk 5 beoogden we de mechanische eigenschappen van long-specifieke ECM hydrogels te wijzigen om gezonde en fibrotische omgevingen na te bootsen. ECM hydrogels gecrosslinkt met ruthenium (Ru) vertoonden verhoogde stijfheid en verminderde spanningsrelaxatie zonder veranderingen in de samenstelling. Analyse van vezelstructuren liet zien dat gecrosslinkte hydrogels een hogere vezeldichtheid en kortere gemiddelde vezellengte vertoonden. Wanneer fibroblasten op deze hydrogels werden gekweekt, vertoonden ze myofibroblastdifferentiatie, gekenmerkt door verhoogde expressie van α-smooth muscle actine en morfologische veranderingen. Dit systeem bood een in vitro model om de mechanische effecten van ECM tijdens de progressie van longfibrose te bestuderen.

In Hoofdstuk 6 breidden we de Ru-crosslinkingstrategie uit naar huid-afgeleide ECM-hydrogels. Door gebruik van een op maat gemaakte mal en diffusie van ruthenium in huid-ECM-hydrogels genereerden we ECM-hydrogels met een stijfheidsgradiënt die de overgang van normale huid naar littekenweefsel in vivo nabootst. Langs deze gradiënt vertoonden regio’s met hogere stijfheid dichter collageen en tragere spanningsrelaxatie, wat een extra Maxwell-element vereiste bij curve-fitting van de spanningsrelaxatie. Fibroblasten reageerden op deze gradiënt door oriëntatie, ECM-remodelleringsgedrag en lokale stijfheid aan te passen. 3D-ingekapselde fibroblasten oriënteerden zich rond de 45° in regio’s onder 120 kPa, terwijl ze eerst de stijfheid verminderden voordat ze zich heroriënteerden in gebieden boven 120 kPa. Naast veranderingen in fenotype, remodelleerden fibroblasten ook hun omringende ECM op een stijfheidsafhankelijke manier. In gebieden met hoge stijfheid maakten fibroblasten collageenarme holtes rond de cellen, terwijl ze in gebieden met lage stijfheid verstrengelde collageenbundels vormden. Deze resultaten tonen aan dat fibroblasten hun omgeving actief remodelleren om een optimale mechanische en topografische omgeving te creëren.

Hoofdstuk 7 onderzocht hoe ECM stijfheid matrixremodellering beïnvloedt door mesenchymale stamcellen afkomstig van de menselijke navelstreng (UC-MSCs) in huid ECM hydrogels. De resultaten toonden aan dat UC-MSCs stijfheidsafhankelijk gedrag vertoonden: in zachte hydrogels (1,2 kPa, een lage basisstijfheid) veroorzaakten ze contractie-gedreven verstijving; bij medium stijfheid (3,4 kPa, gelijkend aan normale huid) namen cellen een spoelvormige morfologie aan en behielden ECM integriteit; in stijve hydrogels (17,7 kPa, vergelijkbaar met littekenweefsel) bleven cellen ronder en bevorderden ECM afbraak, resulterend in lokale holtevorming en afname van stijfheid. Mechanistisch werd het mechanosensitieve ionkanaal Piezo1 geïdentificeerd als regulator van deze reacties, aangezien remming van Piezo1 de uitkomsten beïnvloedde – contractie werd verminderd in zachte hydrogels en ECM afbraak werd verminderd in stijve hydrogels. Interessant genoeg was de expressie van MMP2 en MMP14 weliswaar stijfheidsafhankelijk, maar werd deze niet beïnvloed door Piezo1-remming, wat wijst op aanvullende mechanotransductiepaden. Deze studie benadrukte de rol van Piezo1 in het mediëren van stijfheidsafhankelijke ECM remodellering door UC-MSCs.

Samenvattend bevordert dit proefschrift ons begrip van hoe ECM mechanica cellulair gedrag en remodellering beïnvloedt. Het introduceert veelzijdige in vitro modellen die fibrotische micro-omgevingen nabootsen, belicht sleutelmechanotransductieroutes zoals Piezo1, en biedt een basis voor de toekomstige identificatie van potentiële doelwitten voor de ontwikkeling van antifibrotische therapieën en strategieën in regeneratieve geneeskunde.